本發明為一種改良的定量檢測海水青鳉魚卵黃原蛋白的試劑盒、制備方法及應用,屬于環境監測領域。試劑盒中包括1塊空白96孔酶標板、1支海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白標準品、1支兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體、1支辣根過氧化物酶標記的兔抗海水青鳉魚卵黃原蛋白抗體、包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液及終止液各1支。通過“凝膠過濾層析+離子交換層析”兩步法分離純化了海水青鳉魚卵黃脂磷蛋白,獲得的卵黃脂磷蛋白與卵黃原蛋白具有相同的免疫原性,作為檢測卵黃原蛋白的標準品,且熱穩定性更佳。本試劑盒可以快速、靈敏的定量檢測海水青鳉魚樣本中的卵黃原蛋白,能夠為海洋環境雌激素污染的生物監測提供技術手段。