[00045132]具有內毒素吸附能力的耶氏酵母和內毒素減毒大腸桿菌

　　1成果簡介
　　研發有效的內毒素LPS脫毒方法具有重要意義，本項目一方面通過KDO定量方法檢測對LPS分子的吸附能力，從發酵食品中篩選到LPS吸附能力最強酵母菌株CSW。證實LPS與Y。 lipolytica細胞共存一段時間后，會產生LPS含量降低的現象。通過18s r DNA分析，菌株CSW1與1。0 mg/m L來源于E。 coil O111：B4的LPS共存后，可使LPS水平降低約70%，而S。 cerevisiae BY4742僅使 LPS含量近30%。
　　另外一方面，過敲除大腸桿菌E。 coli染色體基因上與LPS合成相關基因，構建了多株能夠直接合成新型特殊結構Kdo2-lipid A的突變菌株，具有低內毒素，適合用于大腸桿菌表達宿主生產各種蛋白及氨基酸。
　　2關鍵技術
　　脂多糖LPS是存在于大多數革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分，可通過激活宿主細胞內TLR4受體信號轉導途徑等，促進炎性細胞分泌多種細胞因子，進而引發強烈的免疫反應，造成疾病或者死亡，在食品和藥品中是重要的毒力因子，因此研發有效的LPS脫毒方法具有重要意義。本成果獲得了食品級的LPS脫毒菌株，具有應用前景。
　　工業發酵中大腸桿菌野生型菌株中內毒素釋放，是導致熱原污染的重要原因，這增加了分離純化成本，本成果從源頭改造獲得低毒性的大腸桿菌平臺菌株，避免了發酵工程中熱原產生。
　　3知識產權
　　一株具有內毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法201410713700。5
　　？一種低毒含五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A的制備與應用201510282822。8
　　4項目成熟度；
　　本成果對酵母菌株脫毒進行了系統驗證，采用熒光示蹤法分析了酵母菌株對 LPS 的吸附特性。通過不同LPS孵育濃度下的觀察結果均表明，Y。 lipolytica細胞表面呈現出明顯的LPS附著現象，結合LPS定量結果，可以推測解脂耶氏酵母反應體系中LPS含量明顯降低（~70%）與其細胞表面的LPS吸附特性有關；最后分析了酵母對LPS脫毒機制，因此本成果具有重要理論基礎。
　　通過基因工程改造獲得五株E。 coli突變菌株，所合成的LPS缺失了多糖長鏈，變為結構特殊的Kdo2-lipid A結構，通過用活菌體直接刺激HEK-Blue hTLR4細胞，發現五株突變菌株的細胞激起TLR4信號通路的活性比野生型W3110均有所下降；細胞毒性大幅降低。
　　5投資期望及應用情況
　　LPS又稱內毒素，是存在于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜表面的一種大分子物質，一般只有在細胞死亡或分解時自行釋放到周圍介質中，特殊條件下也可以從活細胞中直接泄漏出來。因此如何脫除LPS具有重要應用前景，將為食品和制藥行業熱原去除提供新的解決方法。本成果中的食品級酵母菌株，具有重要推廣價值，減毒的大腸桿菌菌株也是工業發酵的良好宿主和底盤細胞。